Optimisation of Extraction Process of Sapindus mukorossi Gaertn. Flowers and in vitro Antioxidant and Whitening Activities
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摘要:
以总皂苷得率为指标, 采用单因素和正交试验优化无患子花总皂苷水提取工艺, 对比无患子花水提液与无患子果皮水提液中的总皂苷、总黄酮和总酚含量。通过DPPH·、ABTS+·、O2-·清除实验以及铁离子还原能力测定评价无患子花水提液抗氧化能力；通过酪氨酸酶活性抑制实验, 探究其美白效果；通过红细胞溶血试验, 探究无患子花水提液的刺激性。结果表明：无患子花水提液的最佳提取条件为提取温度80 ℃、提取时间180 min、液料比30∶1(mL∶g), 此条件下, 总皂苷得率为12.15%。无患子花水提液的总皂苷、总黄酮和总酚含量较无患子果皮高；无患子花与果皮的水提液抗氧化能力及酪氨酸酶活性抑制能力较好, 且无患子花水提液优于果皮水提液。无患子花水提液的HD50/DI>100, 根据红细胞溶血试验刺激性分级标准, 表明无患子花水提液无刺激性。
Abstract:Single-factor and orthogonal tests were used to optimize the extraction process of total saponins from Sapindus mukorossi Gaertn. flowers, using the total saponin yield as an indicator. The total saponins, flavonoids and phenols contents in the water extracts of S. mukorossi Gaertn. flowers and pericarp were compared. Furthermore, the antioxidant activity was evaluated by DPPH·, ABTS+·, O2-· radical scavenging test, and ferric ion reducing ability assay. The whitening effect was explored by tyrosinase activity inhibition test, and the irritant properties were investigated by red blood cell haemolysis test. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows: extraction temperature of 80 ℃, extraction time of 180 min and liquid-solid ratio of 30(mL/g). Under these conditions, the total saponins yield was 12.15%. The contents of total saponins, flavonoids and phenols in the water extract of S. mukorossi Gaertn. flower were higher than that of pericarp. The antioxidant capacity and tyrosinase activity inhibiting ability of the S. mukorossi Gaertn. flower water extract were good, which were better than that of pericarp. The HD50/DI>100 of the aqueous extract of S. mukorossi Gaertn. flowers, according to the erythrocyte haemolysis test irritation grading criteria, indicated that the aqueous extract was non-irritating.
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Keywords:
- Sapindus mukorossi Gaertn.flowers /
- saponins /
- flavonoids /
- antioxidant /
- tyrosinase
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无患子(Sapindus mukorossi Gaertn.), 俗名油患子、苦患树、洗手果等, 主要分布于中国长江流域以南及印度、日本和朝鲜等。无患子具有较高的经济和生态效益[1], 能够适应高温、干旱、盐碱地各种恶劣条件, 被用于城市景观树。历代中药典籍记载了无患子多以果实、根、叶片和种仁入药[2], 具有一定的药用价值。无患子化学成分丰富, 皂苷是其主要活性成分, 此外, 无患子果实和根部还含有油脂类、黄酮类、酚类、蛋白质、氨基酸等成分[3]。无患子中含有的皂苷成分作为一种天然表面活性剂被用于洗发香波、洗面奶等各种洗护产品中, 无患子还具有抑菌和杀菌[4-5]、抗氧化[6]、抑制酪氨酸酶[7]、抗炎[8]以及抗肿瘤[9-10]等多种生物活性。Chen等[11]采用响应面法优化无患子果皂苷提取工艺, 所得提取物对DPPH·的清除率为91.56%；赵志敏等[12]研究发现无患子总皂苷在低质量浓度(0.312 5 g/L)时, 对酪氨酸酶的抑制能力与熊果苷相当；而当质量浓度为2 g/L时, 抑制率仅为41.67%, 远不及熊果苷效果好。陈雷等[13]研究发现1 g/L无患子果皮提取物对酪氨酸酶活性的抑制率达80.23%, 证明了果皮提取物具有美白能力。目前, 国内外对无患子的研究报道多集中于果皮部位, 对无患子的开发利用也集中在果皮、种仁部位, 而对花的相关研究较少。无患子花中富含皂苷和黄酮类活性物质[14]。钱天元等[15]提取无患子花色素并研究其理化性质, 通过自由基清除实验发现无患子花水提取液具有一定的抗氧化能力。但是目前对无患子花的提取工艺优化及其酪氨酸酶抑制能力的研究还未见报道。因此, 本研究采用单因素和正交试验对水提法提取无患子花总皂苷工艺条件进行优化, 比较无患子花水提液与果皮水提液的主要活性成分、抗氧化能力及酪氨酸酶抑制能力的差异, 并对无患子花水提液的刺激性进行评价, 以期提高无患子的综合利用率并为无患子花在化妆品领域的应用提供理论支持。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
YS-08型中药粉碎机, 北京燕山正德机械设备有限公司；LGJ-18型真空冷冻干燥机, 北京松源华兴科技有限公司；Infinite M200 pro多功能酶标仪, 瑞士Tecan公司；TGL-25M台式大容量高速冷冻离心机, 上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
无水乙醇、高氯酸、过硫酸钾、硫酸亚铁、冰醋酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠均为分析纯；2, 2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基(DPPH自由基)、酪氨酸酶, 上海麦克林生化科技有限公司；2, 2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、十二烷基硫酸钠, 上海阿拉丁生化科技有限公司；L-多巴, 上海源叶生物科技有限公司；香草醛、Tris-HCl缓冲液, 无菌脱纤维绵羊血, 北京索莱宝科技有限公司；抗坏血酸, 天津福晨化学试剂有限公司。
无患子花, 2022年6月上旬采摘于福建三明地区；无患子果, 2022年10月采摘于福建三明地区。将花与果皮在-20 ℃冷冻保存, 真空冷冻干燥机干燥、中药研磨机粉碎, 过0.3 mm孔径筛后备用。
1.2 无患子花总皂苷提取条件的优化
以无患子花提取液总皂苷得率为评价指标, 称取1 g的无患子花粉末, 置于50 mL离心管中, 按一定液料比加入去离子水为提取溶剂, 在水浴锅中一定温度下加热提取一段时间，结束后于4 500 r/min离心15 min, 取上清液用于无患子花提取液总皂苷得率的测定。实验中选取提取温度(40、50、60、70、80 ℃)、液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL∶g))和提取时间(20、60、100、140、180和220 min)这3个单因素条件进行考察。根据上述单因素试验结果, 采用正交试验设计对这3个工艺参数进一步优化, 明确最佳提取条件。实验中还制备了最佳提取条件下无患子果皮水提液用于研究无患子花水提液抗氧化及美白活性的对比。
1.3 无患子花水提液中主要成分的测定
$$Y=m / m_0 \times 100 \%$$ 采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法[17]测定无患子花提取液中总黄酮质量, 采用FoLin-CiocaLteu法[18]测定无患子花提取液中总酚质量, 按式(2)进行计算。
$$m=c \times n \times v$$ 式中：m—总皂苷/总黄酮/总酚质量, mg；c—稀释后的水提液的总黄酮/总多酚/总皂苷质量浓度, mg/L；n—稀释倍数；v—水提液体积，L。
采用香草醛-冰醋酸法[16]测定无患子花提取液中总皂苷质量。总皂苷得率(Y)与质量按式(1)、式(2)进行计算。
式中：m—总皂苷质量, mg；m0—无患子花粉末质量, mg。
1.4 无患子花水提液的抗氧化活性测定
1.4.1 DPPH·清除率
$$C=\left[1-\left(A^{\prime}-A_0\right) / A\right] \times 100 \%$$ 式中：C—自由基清除率，%；A′—反应样品的吸光度；A0—本底吸光度；A—空白吸光度。
参照Wang[19]方法略做修改, 在96孔板中加入20 μL 1.2节得到的最优提取条件提取的无患子花或果皮水提液(用去离子水稀释成不同体积分数)以及180 μL DPPH溶液(150 μmol/L), 置于室温下, 用锡箔纸包裹反应30 min, 517 nm波长下测吸光值。空白对照为无水乙醇, 阳性对照为Vc溶液(100、150、200、250、300、350 mg/L), 本底对照将DPPH溶液替换为无水乙醇。按照式(3)计算DPPH·清除率。
1.4.2 ABTS+·清除率
将7.4 mmol/L ABTS溶液与2.6 mmol/L过硫酸钾溶液按体积比1∶1混匀配制ABTS母液, 在黑暗室温条件下反应12~15 h后, 用无水乙醇将ABTS母液稀释至体积为原来的40~50倍, 使稀释液在734 nm的吸光度为0.7±0.02即得ABTS工作液。取40 μL 1.2节得到的最优提取条件提取的无患子花或果皮水提液(用去离子水稀释成不同体积分数)于96孔板中, 加入160 μL ABTS工作液, 振摇10 s混合后在室温条件下用锡箔纸包裹反应6 min, 734 nm处测吸光值。空白对照为无水乙醇, 本底对照将ABTS溶液替换为水, 阳性对照为Vc溶液(20、40、60、80、100、120 mg/L)。按照式(3)计算ABTS+·清除率。
1.4.3 铁离子还原能力(FRAP)
配制2, 4, 6-三吡啶基三嗪(TPTZ)工作液。醋酸缓冲液：称2.04 g醋酸钠，加冰醋酸8 mL，加蒸馏水定容至100 mL，得到pH值为3.6的醋酸缓冲液。10 mmol/LTPTZ：称15.6 mg TPTZ，溶于5 mL水中，加2~3滴浓盐酸，摇匀，至完全溶解方可使用。20 mmol/L氯化铁：称0.54 g氯化铁六水合物溶于100 mL蒸馏水中；将醋酸缓冲液、10 mmol/LTPTZ和20 mmol/L氯化铁这3种试剂按照体积比10∶1∶1混合即TPTZ工作液。FeSO4标准曲线：在96孔板中, 加入20 μL不同质量浓度(0、1、10、50、100、200、400 mg/L)的FeSO4溶液, 再加入180 μL TPTZ工作液, 用锡箔纸包裹避光于室温下反应5 min, 596 nm处测吸光值。样品测定：96孔板中加入20 μL 1.2节得到的最优提取条件提取的无患子花或果皮水提液(用去离子水稀释成不同体积分数), 加入180 μL TPTZ工作液, 混匀, 用锡箔纸包裹，避光于室温下反应5 min, 596 nm处测吸光值。空白对照为200 μL蒸馏水，阳性对照为Vc溶液(20、40、60、80、100 mg/L)。根据标曲计算反应后溶液中FeSO4浓度。
1.4.4 O2-·清除率
参照谢红[20]方法, 略做修改。96孔板中加入50 mmol/L pH值8.34的Tris-HCl, 每孔90 μL, 再加入60 μL蒸馏水, 40 μL 1.2节得到的最优提取条件提取的无患子花或果皮水提液(用去离子水稀释成不同体积分数), 5 mmol/L的邻苯三酚10 μL, 摇匀, 室温下放置20 min, 320 nm处测吸光值, 本底对照将邻苯三酚替换成水, 空白对照为蒸馏水, 阳性对照为Vc溶液(62.5、125、250、500、1 000 mg/L)。按照式(3)计算超氧阴离子自由基清除率。
实验体系
Experimental system
体系 待测样品/μL sample PBS/μL 酪氨酸酶/μL tyrosinase 左旋多巴溶液/μL L-dopa A 60 0 30 120 B 60 30 0 120 C 0 60 30 120 D 0 90 0 120 1.5 无患子花水提液的酪氨酸酶抑制活性测定
参考行业标准T/SHRH015-2018《化妆品-酪氨酸酶活性抑制实验方法》[21], 略做修改。对无患子花水提液的酪氨酸酶活性抑制率进行测定。空白对照为pH值6.8的PBS溶液, 阳性对照为Vc溶液(125、250、500、1 000、2 000 mg/L)。首先按照表 1在96孔板中添加待测样品、PBS溶液和100 U/mL的酪氨酸酶溶液, 将样品与酪氨酸酶充分混匀, 置于37 ℃水浴槽反应10 min。然后依次在各孔中加入120 μL的左旋多巴溶液, 控制每孔反应时间为5 min, 即刻用酶标仪在波长475 nm处测定吸光值(A)。酪氨酸酶抑制率(%)=[1-(AA-AB)/(AC-AD)]×100%。
1.6 无患子花水提液的红细胞溶血实验
$$H=\left(A_1-A_2\right) /\left(A_3-A_2\right) \times 100 \%$$ 式中：A1、A2和A3—分别为样品组、阴性对照组和完全溶血对照组在560 nm的吸光度；A575、A540—样品组在575和540 nm的吸光度；A′575、A′540—0.1%SDS在575和540 nm的吸光度；H—溶血率, %；DI—血红蛋白变性率, %。
$$\mathrm{DI}=\left(A_{575} / A_{540}\right) /\left(A^{\prime}{ }_{575} / A^{\prime}{ }_{540}\right)$$ 参照俞婕方法[22], 略作修改, 用PBS缓冲液将水提液稀释, 将不同体积分数水提液与红细胞悬液以1∶1体积混合, 并于32 ℃, 200 r/min转速下振荡10 min。振荡结束后10 000 r/min离心1 min以终止反应。吸取上清液用酶标仪测试560、540、575 nm处的吸光度值, 每管样品采用3个复孔测定吸光度值, 剔除异常数据后取平均值。完全溶血对照为蒸馏水, 阴性对照为PBS缓冲液。溶血率和血红蛋白变性率按式(5)和式(6)计算。
1.7 数据分析
差异显著性分析使用软件IBM SPSS Statistics 25中的t-检验。
2. 结果与讨论
2.1 无患子花总皂苷提取条件的单因素试验结果
2.1.1 提取温度对总皂苷得率的影响
在液料比15∶1(mL∶g)、提取时间60 min、提取溶剂为蒸馏水条件下, 不同提取温度对无患子花提取液中总皂苷得率影响见图 1(a)。在40~60 ℃之间，无患子花总皂苷得率无显著性变化, 而从60到80 ℃之间, 提取液中总皂苷得率随着提取温度升高而升高, 提取温度为80 ℃时, 总皂苷得率最高。这与滇重楼茎叶总皂苷提取工艺研究结果一致, 提取得率随温度升高而增加[23]。这是因为在一定温度范围内, 温度升高, 分子运动越剧烈, 扩散速度增快, 有利于活性物质溶出, 提取效果较好[24]；但温度过高时, 部分皂苷可能会水解, 同时提取成本也提高。
2.1.2 提取时间对总皂苷得率的影响
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图 1不同提取条件对无患子花提取液中总皂苷得率的影响
Figure 1.Effect of different extraction conditions on the yield of total saponins in soapberry flower extract
在液料比15∶1(mL∶g)、提取温度50 ℃、提取溶剂为蒸馏水条件下, 不同提取时间对无患子花提取液的总皂苷得率影响见图 1(b)。在20~140 min之间, 总皂苷得率随着提取时间增加而增加, 提取时间为140 min时, 总皂苷得率最高, 随后随着时间增加而下降。这与刘俊宏等[25]研究结果类似, 提取无患子总皂苷过程中, 总皂苷得率与提取时间先呈正相关, 达到峰值后则变化不明显, 这可能是因为提取时间在一定范围内增大, 溶质中活性物质在溶剂中溶出增多, 但活性物质溶出到达一定浓度后, 其扩散的速度变慢, 逐渐趋于平衡[26]。
2.1.3 液料比对总皂苷得率的影响
在提取温度80 ℃、提取时间60 min、提取溶剂为蒸馏水条件下, 不同液料比对无患子花提取液的皂苷得率影响见图 1(c)。液料比从15∶1提升到30∶1(mL∶g), 总皂苷得率先升高再下降, 液料比为25∶1(mL∶g)时, 总皂苷得率最高。Hu等[27]提取金花茶皂苷时发现, 在液料比30∶1~50∶1(mL∶g)时, 皂苷得率随着溶剂体积增加而增大, 在50∶1时最高, 而后开始下降；提取文冠果果核脱脂残渣中三萜皂苷的研究亦有类似结果[28]。这可能是因为皂苷在无患子花粉末与溶剂之间的浓度差越大, 越有利于提高皂苷的传质速率, 但溶剂量过大时则不利于溶质与溶剂间循环交换, 导致提取率降低[24], 同时溶剂量过多提取成本也相应增大。
2.2 无患子花总皂苷提取条件的正交优化结果
2.2.1 正交试验结果
无患子花总皂苷的提取条件优化的正交试验结果
Orthogonal test results of optimization of extraction conditions of total saponins from soapberry flowers
编号
No.A
液料比(mL∶g)
ratio of liquid to solidB
提取时间/min
extraction timeC
提取温度/℃
extraction temperatureD
空白列
blank column总皂苷得率/%
saponins yield1 20 100 60 1 11.07 2 20 140 80 2 10.61 3 20 180 70 3 10.72 4 25 100 80 3 12.35 5 25 140 70 1 11.82 6 25 180 60 2 12.17 7 30 100 70 2 12.47 8 30 140 60 3 12.25 9 30 180 80 1 12.79 k1 10.8002 11.9629 11.8284 11.8899 k2 12.1136 11.5600 11.6700 11.7517 k3 12.5023 11.8933 11.9176 11.7745 R 1.7021 0.4029 0.2475 0.1382 根据单因素试验结果, 以总皂苷得率为评价指标, 选取液料比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)3个因素进行正交试验, 结果见表 2。由极差分析可知，对总皂苷得率影响最大的因素是液料比、其次为提取时间和提取温度。选取较佳提取工艺为A3B1C3或A3B3C3, 即液料比30∶1(mL∶g)、提取时间为100 min、提取温度为80 ℃或液料比30∶1(mL∶g)、提取时间为180 min、提取温度为80 ℃。
2.2.2 验证试验
按较佳提取条件进行验证试验, 在提取条件为A3B1C3时, 总皂苷得率为11.43%, RSD值为4.9%；在提取条件为A3B3C3时, 总皂苷得率较高(12.15%)且RSD值小(1.39%), 说明此提取条件下结果稳定, 即最佳提取条件为液料比30∶1(mL∶g)、提取时间为180 min、提取温度为80 ℃。
无患子花与果皮水提液中的总皂苷、总黄酮、总酚1)
Mass fractions of total saponins, total flavonoids and total phenols in aqueous extracts of soapberry flowers and pericarp
% 水提液来源 总皂苷
total saponin总黄酮
total flavonoid总酚
total phenolic1)*代表显著性差异, p<0.05 *represents a significant difference, p<0.05 花flowers 128.80±0.94* 28.23±0.60* 97.21±1.87* 果皮pericarp 111.76±4.10 4.42±0.09 14.19±1.03 2.2.3 无患子花与无患子果皮水提液中的主要活性成分
最优提取条件下得到的无患子花水提液与果皮水提液中的总皂苷、总黄酮及总酚质量分数测定结果见表 3。由数据可知，无患子花水提液中总黄酮、总皂苷、总酚含量均显著高于无患子果皮水提液中的。
2.3 无患子花水提液的抗氧化活性
2.3.1 DPPH·清除率
无患子花水提液与果皮水提液对DPPH·清除率如图 2(a)所示。阳性对照Vc溶液在质量浓度100~350 mg/L之间对DPPH·清除率为61.53%~96.73%。无患子果皮水提液对DPPH·清除率随体积分数增加而增大, 具有用量依赖性, 体积分数100%时，无患子果皮水提液对DPPH·清除率为91.98%, 无患子花水提液对DPPH·清除率则为90.28%, 随着提取液的稀释, 无患子花水提液的抗氧化能力依然保持良好；体积分数为3.125%时, 果皮水提液对DPPH·清除率下降至28.06%, 无患子花水提液的DPPH·清除率则高达88.25%, 高于100 mg/L的Vc。
2.3.2 ABTS+·清除率
无患子花水提液与果皮水提液的ABTS+·清除效果如图 2(b)所示。Vc溶液在20~120 mg/L之间对ABTS+·清除率为73.34%~99.63%。无患子花与果皮水提液对ABTS+·的清除率随其体积分数增加而增大, 具有用量依赖性, 且在体积分数为0.312 5%~1.875%之间时, 无患子花水提液对ABTS+·清除率高于无患子果皮水提液。水提液体积分数为1.875%时, 无患子花水提液对ABTS+·清除率高达99.54%, 无患子果皮水提液对ABTS+·清除率为79.47%。水提液体积分数为0.312 5%时, 无患子花水提液对自由基清除率与20 mg/L的Vc溶液相当。由此可见, 无患子花与果皮水提液对ABTS+·清除能力均较好, 且无患子花水提液要优于无患子果皮水提液。
2.3.3 铁离子还原能力(FRAP)
无患子花与果皮水提液的铁离子还原能力见图 2(c)。Vc溶液在20~100 mg/L之间FRAP值为50.72~282.39。无患子花与果皮水提液的铁离子还原能力具有用量依赖性, 水提液体积分数越大, FRAP值越大, 对铁离子还原能力越强。水提液体积分数为1.25%~6.25%时, 无患子花水提液的铁离子还原能力高于果皮水提液；水提液体积分数为6.25%时, 无患子花水提液铁离子还原能力与质量浓度为100 mg/L的Vc溶液相当, 说明无患子花水提液具有较好的铁离子还原能力。
2.3.4 O2-·清除活性
无患子花与果皮水提液对O2-·的清除作用如图 2(d)所示。Vc溶液在62.5~100 mg/L之间对O2-·清除率为37.60%~98.77%。水提液体积分数在6.25%~100%之间, 无患子花与果皮水提液对O2-·清除率均随着体积分数增加而增大；体积分数为6.25%~25%时, 无患子果皮水提液对O2-·清除率略高于无患子花水提液, 但当水提液体积分数升至50%~100%时, 无患子花水提液对O2-·清除能力显著高于果皮水提液。水提液体积分数为6.25%时，无患子花水提液对O2-·清除率与62.5 mg/L的Vc溶液相当。体积分数100%时无患子花水提液对O2-·清除率高达95.15%。
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图 2不同体积分数的无患子花和果皮水提液的抗氧化活性
Figure 2.Antioxidant activity of aqueous extract of soapberry flowers and pericarp at different volume fractions
总体来看, 无患子花的抗氧化能力要优于无患子果皮, 这可能是由无患子花与果皮中皂苷、黄酮和多酚类成分含量的差异造成的。Shah等[6]研究发现无患子茎皮不同极性萃取物的多种抗氧化活性与其总酚和总黄酮含量呈显著正相关。除黄酮和多酚以外, 皂苷也具有抗氧化活性[29-30]。Silva[31]发现无患子果实粗提物以及三萜皂苷在DPPH、FRAP等体外抗氧化试验中具有较高的抗氧化能力, 其中三萜皂苷在100 mg/L时活性最好。
2.4 无患子花水提液的酪氨酸酶活性抑制能力
酪氨酸酶是一种多功能氧化酶, 它参与黑色素形成过程中多个步骤, 通过抑制其活性, 可以有效阻止黑色素的生成[32]。图 3是无患子花与果皮水提液的酪氨酸酶抑制实验结果。阳性对照Vc在125~2 000 mg/L之间对酪氨酸酶活性抑制率为37.60%~98.77%。由图可以看出，水提液体积分数为6.25%~100%时, 无患子花水提液均保持着良好的酪氨酸酶活性抑制能力, 抑制率最高为92.76%；无患子果皮水提液的酪氨酸酶抑制率则随水提液体积分数增大而升高, 最高为88.06%；水提液体积分数为6.25%时, 无患子花水提液的酪氨酸酶抑制能力高于125 mg/L的Vc溶液。无患子花与果皮水提液的酪氨酸酶抑制能力较好, 且无患子花水提液的抑制效果要高于无患子果皮水提液。有研究发现无患子果皮水提发酵液和半制备HPLC获得的F4级分在质量浓度2 g/L时对酪氨酸酶活性的抑制率为63.88%和67.26%, 同时, F4级分中分析出三萜皂苷, 其酪氨酸酶活性或与此有关[33]。多酚化合物螯合金属离子的能力会影响酪氨酸酶的活性[34], 黄酮类物质如葛根素以可逆混合方式可显著抑制酪氨酸酶活性, 槲皮素、芦丁、白藜芦醇等也都可以抑制酪氨酸酶活性[35]。本研究无患子花水提液具有更优的美白效果, 推测原因，应和其含有的皂苷、黄酮与多酚含量有关。
2.5 无患子花水提液的红细胞溶血实验
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图 3无患子花与无患子果皮水提液的酪氨酸酶抑制率
Figure 3.Tyrosinase inhibition rate of aqueous extract of soapberry flowers and pericarp
通过红细胞溶血实验判断无患子花水提液的刺激性，结果见图 4。图 4显示随着提取液体积分数升高溶血率逐渐增大, 拟合得到的无患子花水提液的50%红细胞发生溶血时的样品质量浓度(HD50)为25 798.77 mg/L, 血红蛋白变性率DI为93.44%, 无患子花水提液的HD50/DI>100, 根据欧洲替代方法验证中心(ECVAM)的红细胞溶血试验刺激性分级标准[36], 表明无患子花水提液无刺激性。
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图 4无患子花水提液的红细胞溶血率
Figure 4.Erythrocyte haemolysis rate of water extract of soapberry flowers
3. 结论
采用单因素和正交试验设计优化无患子花总皂苷提取工艺, 确定无患子花水提液的最佳提取条件为液料比30∶1(mL∶g)、提取时间180 min、提取温度80 ℃。无患子花水提液中总皂苷、总黄酮和总酚含量均高于无患子果皮水提液。
无患子花水提液与果皮水提液均具有较好的抗氧化能力, 无患子花水提液对DPPH·、ABTS+·和O2-·清除率最高分别达到90.28%、99.54%和95.15%；果皮水提液最大清除率则分别为91.98%、79.47%和63.54%。无患子花水提液的铁离子还原能力较好, 果皮水提液则稍逊。
无患子花水提液的酪氨酸酶活性抑制能力优于无患子果皮水提液, 水提液体积分数为6.25%时, 无患子花水提液酪氨酸酶抑制率(87.30%)远高于果皮水提液抑制率(25.17%), 说明无患子花水提液具有较好的美白护肤功效。无患子花水提液的HD50为25 798.77 mg/L, HD50/DI>100, 表明无患子花水提液无刺激性, 此结果为无患子花在化妆品中的利用提供了可能性。
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图 1
不同提取条件对无患子花提取液中总皂苷得率的影响
Figure 1.
Effect of different extraction conditions on the yield of total saponins in soapberry flower extract
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图 2
不同体积分数的无患子花和果皮水提液的抗氧化活性
a.DPPH·；b.ABTS+·；c.FRAP；d.O2-· Figure 2.
Antioxidant activity of aqueous extract of soapberry flowers and pericarp at different volume fractions
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图 3
无患子花与无患子果皮水提液的酪氨酸酶抑制率
Figure 3.
Tyrosinase inhibition rate of aqueous extract of soapberry flowers and pericarp
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图 4
无患子花水提液的红细胞溶血率
Figure 4.
Erythrocyte haemolysis rate of water extract of soapberry flowers
表 1
实验体系
Table 1
Experimental system
体系 待测样品/μL sample PBS/μL 酪氨酸酶/μL tyrosinase 左旋多巴溶液/μL L-dopa A 60 0 30 120 B 60 30 0 120 C 0 60 30 120 D 0 90 0 120 
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表 2
无患子花总皂苷的提取条件优化的正交试验结果
Table 2
Orthogonal test results of optimization of extraction conditions of total saponins from soapberry flowers
编号
No.A
液料比(mL∶g)
ratio of liquid to solidB
提取时间/min
extraction timeC
提取温度/℃
extraction temperatureD
空白列
blank column总皂苷得率/%
saponins yield1 20 100 60 1 11.07 2 20 140 80 2 10.61 3 20 180 70 3 10.72 4 25 100 80 3 12.35 5 25 140 70 1 11.82 6 25 180 60 2 12.17 7 30 100 70 2 12.47 8 30 140 60 3 12.25 9 30 180 80 1 12.79 k1 10.8002 11.9629 11.8284 11.8899 k2 12.1136 11.5600 11.6700 11.7517 k3 12.5023 11.8933 11.9176 11.7745 R 1.7021 0.4029 0.2475 0.1382
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表 3
无患子花与果皮水提液中的总皂苷、总黄酮、总酚1)
Table 3
Mass fractions of total saponins, total flavonoids and total phenols in aqueous extracts of soapberry flowers and pericarp
% 水提液来源 总皂苷
total saponin总黄酮
total flavonoid总酚
total phenolic花flowers 128.80±0.94* 28.23±0.60* 97.21±1.87* 果皮pericarp 111.76±4.10 4.42±0.09 14.19±1.03 1)*代表显著性差异, p<0.05 *represents a significant difference, p<0.05
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