Extraction, Component Analysis, and Antifungal Activity on Plant Pathogenic Fungi of Zedoary Turmeric Volatile Oil
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摘要:
通过水蒸气蒸馏法从莪术叶中提取莪术挥发油(ZTO)，利用GC-MS仪对其化学成分进行分析，并采用菌丝生长速率法测试了ZTO对水稻纹枯病菌、黄瓜炭疽病菌、玉米弯孢菌、小麦赤霉病菌、苹果腐烂病菌和辣椒疫霉6种植物病原菌的抑制活性；通过透射电镜和激光共聚焦显微镜观察了ZTO对水稻纹枯病菌菌丝超微结构的影响，并分析了ZTO对水稻纹枯病菌生理学和防御酶活性的影响。结果表明：ZTO中含有28种有效成分，其中石竹素3.27%、莪术烯5.69%、桉叶油醇5.73%、蓝桉醇6.27%、莪术酮高达38.16%，其余均低于3%；ZTO对水稻纹枯病菌具有较好的抑制效果，其半数致死浓度(EC50)为14.784 mg/L，略低于阳性对照丙环唑(EC50值为10.521 mg/L)；相比空白组，ZTO处理后水稻纹枯病菌菌丝的鲜质量和干质量分别降低了48.47%和62.86%，菌丝的可溶性蛋白质量分数降低了26.32%，180 min时相对电导率值上升了16.68%，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)酶活均有一定程度的下降，其中SOD和CAT的酶活分别降低37.82%和54.02%。分析表明：ZTO对菌丝细胞膜和细胞壁具有一定的破坏作用，导致菌丝体内电解质大量外泄，ZTO进入菌丝体后对SOD和CAT产生一定的抑制作用，致使菌丝体内的活性氧(ROS)不能得到有效的清除，ROS大量累积，进而造成菌丝体的生理生化功能紊乱，并最终阻碍了菌丝的生长。
Abstract:Zedoary turmeric volatile oil(ZTO) was extracted from zedoary turmeric leaves by steam distillation method, and its chemical composition was analyzed using GC-MS. The inhibitory activities of ZTO against six plant pathogens, including Rhizoctorzia solani, Colletotrichum orbiculare, Curvularia lunata, Fusarium graminearum, Valsa mali, Phytophthora capsici were measured using the mycelial growth rate method. The effect of ZTO on the ultrastructure of R. solani mycelium was observed by transmission electron microscopy and confocal laser confocal microscopy. The effects of ZTO on the physiology and enzyme activity of R. solani were also analyzed. The results showed that ZTO contained 28 effective ingredients, where caryophyllin was 3.27%, curcumene was 5.69%, eucalyptol was 5.73%, eudesmol was 6.27%, curcumone was as high as 38.16%, and the rest was less than 3%. ZTO exhibited a significant inhibitory effect on R. solani, and its median lethal concentration (EC50 value) was 14.784 mg/L, slightly lower than that of the positive control propiconazole(EC50 value of 10.521 mg/L). Compared with the blank group, the fresh and dry weight of R. solani mycelia treated with ZTO decreased by 48.47% and 62.86%, respectively. The soluble protein of the mycelia decreased by 26.32%, and the relative conductivity value increased by 16.68% after 180 minutes. The activities of superoxide dismutase(SOD), peroxidase(POD), catalase(CAT) and polyphenol oxidase(PPO) all decreased to a certain extent, and the activities of SOD and CAT decreased by 37.82% and 54.02%, respectively. The analysis showed that ZTO had a certain destructive effect on the cell membrane and cell wall of mycelium, leading to a considerable amount of electrolyte leakage in the mycelium. After entering the mycelia, ZTO exhibited a certain inhibitory effect on SOD and CAT enzymes, resulting in the reactive oxygen species(ROS) in the mycelium could not be effectively removed and a large amount of ROS accumulation, which further caused physiological and biochemical dysfunction of the mycelium, and ultimately hindered the growth of the mycelium.
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Keywords:
- zedoary leaves /
- zedoary turmeric oil /
- Rhizoctonia solani /
- mode of action
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植物病菌对粮食生产造成了巨大危害，由植物病菌引起的植物病害超过1万种，占全年作物总损失的10%~30%[1-2]，因此，植物病菌的防控刻不容缓。使用传统化学农药控制植物病害虽然操作简单、见效快，但也会给生态环境和人类健康带来严重的灾难[3]。因此，采用绿色科学的防控手段迫在眉睫。莪术为姜科植物蓬莪术、广西莪术的干燥根茎，是广西的道地药材。大量研究表明莪术具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗菌、护肝等多种生物活性[4-5]。莪术叶是莪术植株中非药用部位，含有大量挥发性化合物，具有潜在的开发利用价值。张丹媚等[6]测试了广西莪术挥发油对松赤枯病菌、玉米纹枯病菌、玉米弯孢病菌、胶孢炭疽杆菌、水稻稻瘟病菌和小麦赤霉病菌的抗菌活性，结果表明：广西莪术挥发油对松赤枯病菌具有较好的抑制效果(IC50值为6.8 mL/L)，这是因为广西莪术挥发油能作用于病菌的细胞壁和细胞器，进而达到抗病菌的目的，但是其具体的作用方式并不清晰。菌丝生理学指标的检测，如超微结构的改变、活性氧(ROS)的累计、菌丝质量的变化、细胞膜通透性以及防御酶活性改变等，对于探究广西莪术挥发油(ZTO)的作用方式具有重要的作用。基于上述研究背景，本研究利用水蒸气蒸馏法从莪术叶中提取ZTO，采用菌丝生长速率法测试ZTO的抗病菌活性，通过研究菌丝处理前后生理学的变化初步探究ZTO的作用方式，以期为莪术叶中活性成分的高值化利用提供理论依据。
1. 实验
1.1 原料、试剂与仪器
广西莪术(Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang)叶由广西壮族自治区药用植物园提供，采摘于2023年10月。水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、玉米弯孢菌(Curvularia lunata)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)6种植物病原菌由西北农林科技大学植物保护学院提供；其他试剂均为市售分析纯。
TRACE1310-ISQLT气相色谱-质谱联用(GC-MS)仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；DDB-12H笔式电导率计，杭州齐威仪器有限公司；TECNAI G2 SPIRIT BIO透射电镜(TEM)，美国FEI公司；LEICA TCS SP8激光共聚焦显微镜，德国莱卡仪器有限公司；MULTISKAN GO全波长酶标仪，芬兰THERMO FISH公司。
1.2 莪术挥发油(ZTO)的提取及活性成分分析
ZTO中活性成分的分析：取20 mg ZTO溶于1 mL的甲醇溶液，并在GC-MS仪中测试ZTO的活性成分。色谱条件：TRACE1310-ISQLT气相色谱仪，wm-5ms色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，柱温150 ℃，以3.0 ℃/min升温至230 ℃后，以10 ℃/min升温至280 ℃，保持10 min。进样口温度为250 ℃，载气为氦气，流量0.8 mL/min，进样量为1 μL。质谱条件：电离方式为电子电离(EI)源，传输线温度240 ℃，离子源温度280 ℃，质谱扫描范围55~500 u。
根据文献[7]报道的方法，采用“水蒸气蒸馏法”提取莪术挥发油。首先将阴干的莪术叶粉碎(过粒径为2 mm的筛)，取粉末200 g，采用水蒸气蒸馏法提取4 h，收集油水混合液(约20 mL)，按体积比1 ∶ 10加入石油醚提取9 h，减压蒸馏除去石油醚，二氯甲烷萃取后再减压蒸馏，即得莪术挥发油(ZTO)。
1.3 抗真菌活性测试
式中：DCK—空白组的菌落直径，mm；DT—处理组的菌落直径，mm；5—菌饼的直径，mm。
$$\eta=\left(D_{\mathrm{CK}}-D_{\mathrm{T}}\right) /\left(D_{\mathrm{CK}}-5\right) \times 100 \% $$ 根据文献[8~10]报道的方法，采用菌丝生长速率法测试ZTO对6种植物病原菌的抑制活性。首先，将ZTO溶于二甲基亚砜(DMSO)溶液作为标准液，取适量标准液制备质量浓度为50 mg/L的含药马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。然后，将上述6种植物病原菌接种到PDA中心，并在25 ℃人工气候箱中培养。最后，筛选出抑制率高于50%的植物病原菌，在50、25、12.5、6.25、3.13、1.56 mg/L的质量浓度下进一步测试其抗菌效果。根据式(1)计算其抑制率(η)并通过SPSS 22.0软件计算ZTO对水稻纹枯病菌的半数致死浓度(EC50值)。
1.4 ZTO对水稻纹枯病菌菌丝微观结构的影响
1.4.1 TEM分析
采用TEM观察ZTO处理前后水稻纹枯病菌菌丝的超微结构变化，根据文献[11]报道的方法，分别使用DMSO和ZTO(EC50值)处理的水稻纹枯病菌作为空白组和处理组并进行取样。空白组和处理组经4%戊二醛植物固定液固定6 h以上、PBS漂洗(5、10、15、20、25和30 min各漂洗1次，下同)、1%锇酸固定1.5 h，PBS漂洗；然后，采用等体积比的白胶和乙醇混合液渗透菌丝2次(第一次8 h，第二次6 h)、纯白胶包埋48 h、烘干(60 ℃)、切样和铅铀染色处理后，在TEM下观察菌丝形态。
1.4.2 激光共聚焦显微镜分析
通过激光共聚焦显微镜观察水稻纹枯病菌菌丝体内ROS的累积情况，根据文献[12]报道的方法，将水稻纹枯病菌在PDA培养基上活化培养2 d后，用直径5 mm的打孔器取10个菌饼置于100 mL马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB)中，25 ℃摇床培养1 d后，处理组加入ZTO(EC50值)，空白组加入等体积DMSO，继续培养2 d。将菌丝尖端挑出，用10 μmol/L的2', 7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA) 染色10 min，0.1 mol/L PBS缓冲液漂洗2次，每次10 min，置于载玻片上并使用激光共聚焦显微镜拍照，观察处理前后菌丝体内ROS的累计情况(最大激发波长为495 nm，最大发射波长为529 nm)。
1.5 ZTO对水稻纹枯病菌生理学的影响
1.5.1 菌丝干质量和鲜质量
水稻纹枯病菌的培养方法同 1.4.2节，菌丝经减压抽滤后，用分析天平称量菌丝的鲜质量；60 ℃烘干5 h后测量菌丝的干质量。
1.5.2 菌丝可溶性蛋白含量
水稻纹枯病菌的培养方法同 1.4.2节，根据文献[13]报道的方法：取鲜样0.2~0.5 g，用蒸馏水研磨成匀浆后，3 000~4 000 r/min离心10 min，上清液即为空白组和处理组的提取液。取6支具塞试管，分别加入0、20、40、60、80和100 mg/L的牛血清蛋白标准液1 mL，再向各管中加入5 mL考马斯亮蓝试剂，静置5 min左右，以未添加牛血清蛋白标准液的试管为空白对照，在595 nm下比色，测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。吸取样品提取液1.0 mL(根据蛋白质含量适当稀释)，放入试管中，每个样品重复3次，加入5 mL考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2 min待反应完成，在595 nm下比色，测定吸光度，并通过标准曲线计算蛋白质含量，根据式(2)计算处理组和空白组菌丝的可溶性蛋白质量分数(w，mg/g)。
$$w=m \times V_{\mathrm{t}} /\left(m_{\mathrm{f}} \times V_{\mathrm{s}}\right) $$ 式中：m—从标准曲线计算得到的1 mL提取液中蛋白质的质量，mg；Vt —提取液总体积，mL；mf —样品鲜质量，g；Vs —测定时加样体积，mL。
1.5.3 菌丝细胞膜通透性
细胞膜通透性可以反映ZTO对水稻纹枯病菌的细胞膜损伤，根据文献[14~16]报道的方法：首先将菌丝接种在PDB培养基上，振荡培养3 d，经真空抽滤、无菌水洗涤后称取0.3 g，加入30 mL的蒸馏水，处理组加入ZTO(EC50值)，空白对照组添加等体积的DMSO，每组设置3个重复。最后，使用电导率计测试处理组和空白组在0、30、60、90、120、150和180 min时的电导率值(σ0)和煮沸后菌丝体的电导率值(σ1)，根据式(3)计算处理组和空白组菌丝的相对电导率(R)。
$$R=\sigma_0 / \sigma_1 \times 100 \% $$ 1.6 ZTO对水稻纹枯病菌菌丝防御酶活性的影响
1.6.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性测试
$$Y_{\mathrm{SOD}}=\left(A_{\mathrm{ck}}-A_{\mathrm{e}}\right) \times V /\left(0.5 \times m_{\mathrm{f}} \times t \times V_{\mathrm{t}}\right) $$ 式中：Ack —光照对照管的吸光度值；Ae —样品管的吸光度值；V—酶提取液总体积，mL；mf —样品鲜质量，g；Vt —测定时所用的酶液体积，mL；t—反应时间，min。
水稻纹枯病菌的培养方法同 1.4.2 节，根据文献[17]报道的方法，取鲜样0.5 g，用蒸馏水研磨成匀浆后，3 000~4 000 r/min离心10 min，上清液即为空白组和处理组的粗酶液。取7支试管编号1~7，并加入5 mL的氮蓝四唑(NBT)反应液；1~3号试管加入空白组粗酶液0.15 mL，4~6号试管加入处理组粗酶液0.15 mL并摇匀，7号管不加粗酶液，用于空白调零；25 ℃，5 000 Lx日光下光照20 min后，在560 nm波长下测定吸光度值，SOD活性以抑制NBT光还原50%所需的酶量为1个酶活性单位，根据式(4)计算处理组和空白组菌丝的SOD酶活(YSOD，U/(g · min))。
1.6.2 过氧化物酶(POD)活性测试
$$Y=\left(A_0-A_1\right) \times V /\left(0.01 \times m_{\mathrm{f}} \times t \times V_{\mathrm{t}}\right) $$ 式中：Y—酶活，U/(g · min); A0—初始吸光度值；A1—5 min后吸光度值。
空白组和处理组粗酶液的制备同 1.6.1节，根据文献[18]报道的方法，取7支试管编号1~7，加入pH值6.0的0.05 mol/mL磷酸缓冲液2 mL，2%过氧化氢2 mL、0.05 mol/mL愈创木酚1 mL；1~3号试管加入空白组粗酶液0.15 mL，4~6号试管加入处理组粗酶液0.15 mL并摇匀，7号管不加粗酶液，用于空白调零；470 nm波长下测定初始吸光度值，反应5 min，测定反应后的吸光度值。以每分钟吸光度值变化0.01定义为1个酶活性单位，按照式(5)计算处理组和空白组菌丝的POD酶活。
1.6.3 过氧化氢酶(CAT)活性测试
空白组和处理组粗酶液的制备同 1.6.1节，根据文献[19]报道的方法，取7支试管编号1~7，加入0.2%过氧化氢1 mL, 蒸馏水1.9 mL；1~3号试管加入空白组粗酶液0.1 mL，4~6号试管加入处理组粗酶液0.1 mL并摇匀，7号管不加粗酶液，用于空白调零；立即置于240 nm波长下测定初始吸光度值，3 min后再次测定管内液体的吸光度值。以每分钟吸光度值变化0.01定义为1个酶活性单位，按照式(5)计算处理组和空白组菌丝的CAT酶活。
1.6.4 多酚氧化酶(PPO)活性测试
空白组和处理组粗酶液的制备同 1.6.1 节，根据文献[20]报道的方法，取7支试管编号1~7，加入pH值6.0的0.05 mol/mL磷酸缓冲液3.8 mL，邻苯二酚1 mL；1~3号试管加入空白组粗酶液，4~6号试管加入处理组粗酶液，7号管不加粗酶液，用于空白调零；398 nm波长下测定起始吸光度值；随后在35 ℃恒温水浴保温20 min，迅速冰浴并测定吸光度。以每分钟吸光度值变化0.01定义为1个酶活性单位，按照式(5)计算处理组和空白组菌丝的PPO酶活。
2. 结果与讨论
2.1 莪术挥发油的成分分析
ZTO的总离子流色谱见图 1，其中主要的倍半萜类化合物及其含量见表 1。
ZTO中主要的倍半萜类化合物及其含量
Main sesquiterpenes and their contents in ZTO
编号
No.保留时间/min
retention time化合物名称
compound name分子式
molecular formulaCAS 相对峰面积/%
relative peak area1 13.00 α-蒎烯α-pinene C10H16 80-56-8 0.02 2 13.87 β-蒎烯β-pinen C10H16 127-91-3 0.09 3 14.87 桉叶油醇cineole C10H18O 470-82-6 5.73 4 17.08 樟脑camphor C10H16O 464-48-2 0.92 5 17.32 龙脑DL-2-bornanol C10H18O 464-45-9 2.23 6 17.41 α-松油醇terpineol C10H18O 98-55-5 1.19 7 17.64 4-萜烯醇terpinine-4-ol C10H18O 562-74-3 0.41 8 18.03 桃金娘烯醇(-)-myrtenol C10H16O 515-00-4 0.04 9 18.68 L-乙酸香芹酯carvyl acetate C12H18O2 97-42-7 0.04 10 19.86 乙酸龙脑酯(+)-bornyl acetate C12H20O2 76-49-3 0.06 11 21.11 萜品油烯terpinolene C10H16 586-62-9 0.14 12 22.50 β-榄香烯β-elemene C15H24 515-13-9 0.55 13 23.46 异丁香烯isocaryophyllene C15H24 118-65-0 0.37 14 23.57 香叶烯bicyclogermacrene C15H24 24703-35-3 1.69 15 24.41 石竹烯caryophyllene C15H24 6753-98-6 2.72 16 25.41 莪术烯curzerene C15H20O 17910-09-7 5.69 17 25.53 佛术烯eremophilene C15H24 10219-75-7 0.69 18 26.76 桉油烯醇spathulenol C15H24O 6750-60-3 0.71 19 28.21 蓝桉醇globulol C15H26O 489-41-8 0.96 20 28.87 莪术酮curzerenone C15H18O2 20493-56-5 38.16 21 29.68 古芸烯isospathulenol C15H24O 88395-46-4 1.08 22 29.77 石竹素caryophyllene oxide C15H24O 1139-30-6 3.27 23 30.33 β-桉叶醇β-eudesmol C15H26O 473-15-4 2.66 24 30.47 蓝桉醇globulol C15H26O 489-41-8 6.27 25 32.28 莪术二酮curdione C15H24O2 13657-68-6 0.45 26 33.34 莪术呋喃二烯酮furanodienone C15H18O2 24268-41-5 2.76 27 35.77 莪术双环烯酮curcumenone C15H22O2 100347-96-4 0.14 28 40.94 蓬莪术环氧酮zederone C15H18O3 7727-79-9 1.96 由图 1和表 1可知，ZTO中共鉴定出28种有效成分，包含萜类(单萜、倍半萜)、酮类、醇类、酸(酯)类等化合物。其中，龙脑、α-松油醇、香叶烯、石竹烯、古芸烯、β-桉叶醇、莪术呋喃二烯酮、蓬莪术环氧酮的质量分数在1%~3%之间，石竹素为3.27%，莪术烯为5.69%，桉叶油醇为5.73%，蓝桉醇为6.27%，莪术酮高达38.16%，其余化合物的含量均低于1%。大量文献报道，莪术类化合物具有抗肿瘤[21]、杀菌[22]等生物活性，但是关于农用抗真菌的研究却鲜有报道。
2.2 抗真菌活性分析
莪术挥发油和丙环唑对水稻纹枯病菌的抗病菌活性复筛
In vitro antifungal activity of ZTO and propiconazole on R. solani
样品
sample回归方程
regression equationR2 EC50/(mg·L-1) 95%置信区间
95% confidence interval丙环唑propiconazole y=-3.00+2.98x 0.926 10.521 6.156~16.376 ZTO y=-3.23+2.63x 0.915 14.784 7.610~27.136 由表 2可知，ZTO对水稻纹枯病菌具有较好的抑制效果，其EC50值为14.784 mg/L，略低于阳性对照丙环唑(EC50值为10.521 mg/L)。
在ZTO提取鉴定的基础上，通过菌丝生长速率法测试ZTO质量浓度为50 mg/L时对 1.1 节6种植物病原菌的抑制效果。测试结果表明：ZTO对6种植物病原菌具有不同程度的抑制效果，其中ZTO为50 mg/L时对水稻纹枯病菌的抑制率为92.87%，对其他5种植物病原菌的抑制效果相对较差(抑制率介于5%~20%之间)。ZTO对水稻纹枯病菌的抗病菌活性复筛结果见表 2。
2.3 ZTO对水稻纹枯病菌微观结构的影响
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图 2ZTO处理前后水稻纹枯病菌菌丝的TEM和激光共聚焦显微镜(CLSM)
Figure 2.TEM and confocal laser scanning microscope(CLSM) of R. solani mycelium before and after ZTO treatment
ZTO处理前后水稻纹枯病菌菌丝的TEM图见图 2(a)~图 2(b)。由图可知，未经过处理的菌丝细胞圆润，其细胞膜、细胞壁和液泡等超微结构清晰可见(图 2(a))，而处理组菌丝的细胞呈现出明显的扭曲，细胞膜和细胞壁出现了分离现象(图 2(b))，表明ZTO对水稻纹枯病菌的超微结构具有一定的影响。ROS是一种重要的信号分子，可以参与多种细胞代谢过程，但过量的ROS累积将会氧化脂质和蛋白质，破坏细胞结构，引起细胞膜的破裂和细胞凋亡。ROS染色结果见图 2(c)~图 2(d)。由图可知，空白组呈现出微弱的荧光信号，而处理组荧光信号十分强烈，这表明ZTO能造成ROS的大量累积。由此可以推测：经ZTO处理后，菌丝体内ROS大量累积，菌丝体内代谢紊乱，进而抑制菌丝生长。
2.4 ZTO对水稻纹枯病菌生理学的影响
2.4.1 菌丝生长量
菌丝的干质量和鲜质量可以直观反映ZTO对水稻纹枯病菌生长量的影响，测试结果发现：空白组和处理组的鲜质量分别为1.63和0.84 g，干质量分别为0.35和0.13 g。由数据可以看出，经过ZTO处理后，菌丝的鲜质量和干质量均有明显降低，相比空白组分别降低了48.47%和62.86%。
2.4.2 可溶性蛋白含量
可溶性蛋白是生命体重要的渗透调节物质和营养物质，其含量的增加和积累能提高细胞的保水能力，从而对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用。测试结果发现：空白组和处理组的可溶性蛋白质量分数分别为0.19和0.14 mg/g。可见，经过ZTO处理后，菌丝的可溶性蛋白质量分数降低了26.32%。
2.4.3 细胞膜通透性
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图 3ZTO处理前后水稻纹枯病菌菌丝的相对电导率
Figure 3.Relative conductivity of R. solani mycelium before and after ZTO treatment
相对电导率可以衡量处理前后菌丝体内电解质外渗情况，继而反映ZTO对水稻纹枯病菌细胞膜通透性的影响。ZTO处理前后水稻纹枯病菌菌丝的相对电导率结果见图 3。由图可知，在前60 min内，相对电导率均急速上升，且处理组相对电导率上升更快；60~180 min时，相对电导率值趋于平稳，且处理组最终相对电导率值(68.56%)相比空白组(58.76%)上升了16.68%，表明ZTO对水稻纹枯病菌细胞膜具有一定的破坏作用，这与TEM分析结果基本一致。
2.5 ZTO对水稻纹枯病菌防御酶活性的影响
基于以上结果可以推测：莪术挥发油对菌丝的细胞膜和细胞壁具有一定的破坏作用，导致菌丝体内电解质大量外泄，莪术挥发油进入菌丝体后对SOD和CAT酶产生一定的抑制作用，致使菌丝体内的ROS不能得到有效的清除，进而造成菌丝体的生理生化功能紊乱，并最终阻碍了菌丝的生长。
ZTO处理对水稻纹枯病菌防御酶活性的影响
Effect of ZTO treatment on the mycelial defense enzyme activity of R. solani U/(g · min)
组别group SOD POD CAT PPO 空白组control 2.38 202.94 213.24 40.97 处理组treatment 1.48 189.08 98.04 35.71 SOD是一种源于生命体的活性物质，能将生物体在新陈代谢过程中产生的超氧化物转化为过氧化物，POD具有消除过氧化氢及酚类、胺类、醛类、苯类毒性的双重作用，CAT能催化过氧化氢分解成氧和水，而PPO能消除氧自由基对生物体的伤害。ZTO对水稻纹枯病菌菌丝防御酶活性的影响见表 3。由表 3可知，ZTO对SOD、POD、CAT和PPO酶均有不同程度的抑制作用，其中ZTO对SOD和CAT酶活性影响最为明显，其分别降低37.82%和54.02%。
3. 结论
通过水蒸气蒸馏法从莪术叶中提取莪术挥发油(ZTO)，利用GC-MS仪对其化学成分进行分析，并采用菌丝生长速率法测试了ZTO对6种植物病原菌的抑制活性。结果表明：ZTO中含有28种有效成分，其中石竹素3.27%、莪术烯5.69%、桉叶油醇5.73%、蓝桉醇6.27%、莪术酮高达38.16%；ZTO对水稻纹枯病菌具有较好的抑制效果，其EC50值为14.784 mg/L，略低于阳性对照丙环唑(10.521 mg/L)。
菌丝的生理学测试结果表明：ZTO能造成菌丝体内电解质大量外泄，这是因为ZTO对水稻纹枯病菌的超微结构具有一定的破坏作用；此外，经ZTO处理后菌丝体内ROS大量累积，这是因为莪术挥发油对SOD和CAT酶活具有一定的抑制效果，使SOD和CAT酶活分别下降37.82%和54.02%。本研究为拓展莪术叶在农业病害防治领域的利用提供了一定的理论依据，也为林产资源的深度开发提供了借鉴。
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图 2
ZTO处理前后水稻纹枯病菌菌丝的TEM和激光共聚焦显微镜(CLSM)
CM: 细胞膜cell membrane; CW: 细胞壁cell wall; V: 液泡vacuole; N: 细胞核nucleus
TEM: a.空白组control, b.处理组treatment; CLSM: c.空白组control, d.处理组treatmentFigure 2.
TEM and confocal laser scanning microscope(CLSM) of R. solani mycelium before and after ZTO treatment
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图 3
ZTO处理前后水稻纹枯病菌菌丝的相对电导率
Figure 3.
Relative conductivity of R. solani mycelium before and after ZTO treatment
表 1
ZTO中主要的倍半萜类化合物及其含量
Table 1
Main sesquiterpenes and their contents in ZTO
编号
No.保留时间/min
retention time化合物名称
compound name分子式
molecular formulaCAS 相对峰面积/%
relative peak area1 13.00 α-蒎烯α-pinene C10H16 80-56-8 0.02 2 13.87 β-蒎烯β-pinen C10H16 127-91-3 0.09 3 14.87 桉叶油醇cineole C10H18O 470-82-6 5.73 4 17.08 樟脑camphor C10H16O 464-48-2 0.92 5 17.32 龙脑DL-2-bornanol C10H18O 464-45-9 2.23 6 17.41 α-松油醇terpineol C10H18O 98-55-5 1.19 7 17.64 4-萜烯醇terpinine-4-ol C10H18O 562-74-3 0.41 8 18.03 桃金娘烯醇(-)-myrtenol C10H16O 515-00-4 0.04 9 18.68 L-乙酸香芹酯carvyl acetate C12H18O2 97-42-7 0.04 10 19.86 乙酸龙脑酯(+)-bornyl acetate C12H20O2 76-49-3 0.06 11 21.11 萜品油烯terpinolene C10H16 586-62-9 0.14 12 22.50 β-榄香烯β-elemene C15H24 515-13-9 0.55 13 23.46 异丁香烯isocaryophyllene C15H24 118-65-0 0.37 14 23.57 香叶烯bicyclogermacrene C15H24 24703-35-3 1.69 15 24.41 石竹烯caryophyllene C15H24 6753-98-6 2.72 16 25.41 莪术烯curzerene C15H20O 17910-09-7 5.69 17 25.53 佛术烯eremophilene C15H24 10219-75-7 0.69 18 26.76 桉油烯醇spathulenol C15H24O 6750-60-3 0.71 19 28.21 蓝桉醇globulol C15H26O 489-41-8 0.96 20 28.87 莪术酮curzerenone C15H18O2 20493-56-5 38.16 21 29.68 古芸烯isospathulenol C15H24O 88395-46-4 1.08 22 29.77 石竹素caryophyllene oxide C15H24O 1139-30-6 3.27 23 30.33 β-桉叶醇β-eudesmol C15H26O 473-15-4 2.66 24 30.47 蓝桉醇globulol C15H26O 489-41-8 6.27 25 32.28 莪术二酮curdione C15H24O2 13657-68-6 0.45 26 33.34 莪术呋喃二烯酮furanodienone C15H18O2 24268-41-5 2.76 27 35.77 莪术双环烯酮curcumenone C15H22O2 100347-96-4 0.14 28 40.94 蓬莪术环氧酮zederone C15H18O3 7727-79-9 1.96 
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表 2
莪术挥发油和丙环唑对水稻纹枯病菌的抗病菌活性复筛
Table 2
In vitro antifungal activity of ZTO and propiconazole on R. solani
样品
sample回归方程
regression equationR2 EC50/(mg·L-1) 95%置信区间
95% confidence interval丙环唑propiconazole y=-3.00+2.98x 0.926 10.521 6.156~16.376 ZTO y=-3.23+2.63x 0.915 14.784 7.610~27.136
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表 3
ZTO处理对水稻纹枯病菌防御酶活性的影响
Table 3
Effect of ZTO treatment on the mycelial defense enzyme activity of R. solani U/(g · min)
组别group SOD POD CAT PPO 空白组control 2.38 202.94 213.24 40.97 处理组treatment 1.48 189.08 98.04 35.71
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