0.   引　言

在当前的农业发展进程中，农业生产废弃物循环利用的重要意义正日益凸显^[1]。中药渣是一种富含纤维素、半纤维素、木质素等成分的物质，其年产量逾 3500 万 t，但尚未得到充分开发与利用^[2]。食用菌菌渣产量巨大，且富含蛋白质、多糖等营养物质，但资源化利用程度较低^[3]。若这些中药渣和食用菌菌渣不加充分利用，会造成巨大的资源浪费问题，如果不妥善处理，还会污染周边环境^[2-3]。

近年来，农业废弃物处理及资源循环利用问题受到了广泛关注，已成为研究热点领域之一。在此期间，新型处理技术和方法不断涌现^[4]。其中，堆肥技术作为一种行之有效的资源循环利用方式，在众多技术方法中脱颖而出，受到了学界和业界的高度重视^[5-6]。这一技术为解决农业废弃物问题、实现资源可持续利用提供了极具价值的途径。众多学者针对葡萄枝条、猪粪、污泥等多种类型的农业废弃物开展了堆肥相关研究。通过添加混合微生物、硝化抑制剂以及稻壳炭等物质，有效地加快了堆肥的腐熟速度，提升了堆肥产品的质量^[7-9]。与此同时，部分研究将焦点置于中药渣和食用菌渣的单独堆肥处理上。对于中药渣堆肥而言，其关键在于促进纤维素与木质素的降解^[10]；而食用菌渣堆肥则需着重关注氮素的转化过程^[11]。然而，二者单独堆肥均存在一定局限性，而将中药渣与杏鲍菇菌渣混合堆肥有望克服这些不足。一方面，中药渣中的纤维素和木质素等成分可在混合堆肥过程中为微生物提供更丰富的碳源，促进食用菌渣中氮素的转化^[12]；另一方面，食用菌菌渣含有大量蛋白质以及降解纤维素和木质素的微生物^[13-14]，为中药渣降解提供氮源，其微生物分泌的酶可加速中药渣分解，进而提升整个堆肥过程的效率和质量。因此，研究二者混合堆肥对于优化农业废弃物处理和资源利用具有重要的潜在价值。

目前关于中药渣与杏鲍菇菌渣混合堆肥发酵的研究尚显不足，在二者混合堆肥的适宜比例确定、关键参数的精准控制以及腐熟程度的准确判断等方面，仍存在大量亟待探索的未知领域。与此同时，在农业发展领域，中药渣与食用菌渣单独堆肥发酵制成的有机肥料虽在改善土壤结构、提升土壤肥力方面展现出广阔前景^[15]，且微生物作为堆肥发酵的关键因素，其种类、数量及活性对发酵效率和产物质量有显著影响^[16-17]，但针对二者混合发酵时，微生物群落特性及细菌群落变化的具体影响关系仍不明确，该领域存在亟待填补的研究空白。本研究选取紫苏（Perilla frutescens （L.） Britt.）叶中药渣与杏鲍菇菌渣混合建堆进行自然发酵，对堆肥发酵参数以及营养成分的变化进行全面监测，同时，深入剖析细菌群落的变化情况。以期为农业废弃物的高效处理和有机肥料生产提供创新方法。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

杏鲍菇菌渣，湖南省宇秀生物科技有限公司；紫苏叶中药渣，湖南时代阳光药业股份有限公司；牛粪，永州市思源农业科技有限公司。

1.2   混合堆肥发酵方法

2023年7月至10月在永州市烟草公司烟叶生产技术中心基地开展试验。起始材料为100 t，先将物料粉碎至颗粒直径小于0.5 cm，然后按质量比10∶1∶1经大型搅拌机混合杏鲍菇菌渣、紫苏叶中药渣和牛粪。用尿素调节碳氮比至25/1，喷水使水分含量达到约60%。堆成3条垛（15 m×3 m×1.5 m）自然发酵，每10 d翻堆一次，共80 d，首日记为第1天。分别于升温期（第1天）、高温期（第5天）、降温期（第42天）和腐熟期（第61天）采用对角线五点取样法从堆体顶部、中部和底部采集样本，充分混合后分为两部分。第一部分室温风干、粉碎过0.1 mm筛，用于测定物理性质、有机质、氮、磷、钾和腐殖质；第二部分保存在-80 ℃，以评估细菌多样性。

1.3   测定指标及方法

１）温度、水分含量、pH值和Electrical Conductivity(EC值)：每天早上8:00采用多路温度记录仪记录堆体相关数据。

２）理化指标：有机质、氮、磷、钾依据《有机肥料》（NY/T 525-2021）和《肥料 硝态氮、铵态氮、酰胺态氮含量的测定》（NY/T 1116-2014）标准方法测定；容重、总孔隙度、通气孔隙度、持水孔隙度和腐殖质参照文献测定^[18]。

３）种子发芽指数：称取10 g样品，加50 mL蒸馏水，摇床振荡30 min后离心10 min得上清液。在无菌9 cm培养皿中放滤纸，取20粒质量均匀饱满的白菜种子放入培养皿，加5 mL提取液，以蒸馏水为对照，于25 ℃恒温培养室培养72 h，测定发芽率和根长，每个处理（含对照）重复３次。发芽指数GI=（处理平均发芽率×处理平均根长）/（对照平均发芽率×对照平均根长）×100%。

４）细菌群落组成：采用16S rRNA基因测序分析。操作如下：用磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取样品细菌总DNA，用引物341F（5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’ ）和806R（5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’）对16S rRNA基因的V3-V4区进行扩增，利用Illumina平台对PCR产物测序，通过微科盟生物信息分析云平台进行微生物生物学信息分析。

1.4   数据处理与统计分析

所有试验均重复3次，数据以平均值±标准偏差（SD）表示，使用SPSS和Duncan方法，对数据进行方差分析和多重测试分析。在Ｐ <0.05时表示处理的结果存在差异性显著。采用Microsoft Excel 2019进行作图。

2.   结果与分析

2.1   堆肥过程中温度、湿度、pH 值和电导率的动态变化分析

堆肥过程中温度、湿度、pH 值和电导率是反映堆肥发酵进程和质量的关键参数，与微生物的生长代谢、有机物的分解转化以及堆肥产物的稳定性密切相关。由图1可知，温度在整个发酵过程可分为升温期（1～4 d）、高温期（5～41 d）、降温期（42～60 d）及腐熟期（61～80 d）四个阶段（图1a）。

图  1  堆肥过程中温度、湿度、pH 值和电导率的动态变化分析图

Figure  1.  Analysis diagram of dynamic changes of temperature, humidity, pH value and electrical conductivity(EC) during composting process

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堆肥初期，物料的易分解有机物促使嗜温性微生物繁衍分解而放热，温度快速上升。进入高温期，嗜热性微生物主导，温度进一步提升并维持高位。之后，易分解有机物减少，微生物活动与产热减弱，进入降温期，直至腐熟期，堆肥达稳定态，微生物平稳，温度无大幅波动。水分含量在升温期稳定于62%左右，高温期逐渐下降，降温期继续缓慢下降，腐熟期基本稳定在较低水平（图1b）。堆肥升温期，水分含量稳定在 62% 左右，短期内微生物活动未显著改变其含水量。高温期，温度升高致水分蒸发加快，微生物代谢也消耗水分，含水量逐渐降低。降温期，虽然蒸发减缓，但微生物继续消耗水分，且堆肥物理结构变化削弱保水能力，水分缓慢减少。腐熟期，堆肥性质稳定，水分处于较低且稳定水平。pH 值在升温期稳定于 7.3 ～ 7.5；高温期，含氮有机物分解产生氨气等碱性物质，使 pH 值波动上升；降温期，氨气挥发与酸性物质产生、积累速率相对平衡，pH 值小幅波动且较稳定；腐熟期，有机物分解基本完成，物质转化稳定，pH 值稳定在 8.1 ～ 8.3（图1c）。微生物活动初期可溶性盐溶解释放慢，电导率在升温期从 2.4 mS/cm缓升至 2.6 mS/cm；高温期，有机物快速分解，钾、钠等离子态养分及微生物代谢带电离子大量释放，致电导率急升至 4.9 mS/cm。降温期，有机物分解未停，部分养分继续释放，电导率再缓升至 5.1 mS/cm。腐熟期，堆肥养分释放转化平衡，电导率在 4.8 ～ 5.3 mS/cm间波动（图1 d）。这表明在不同发酵阶段，温度、水分含量、pH值和电导率均呈现出不同的变化趋势，反映了发酵过程中微生物活动、物质转化等多种因素的综合作用。

2.2   堆肥发酵过程中物料物理性质的变化分析

物料的物理性质在堆肥发酵进程中扮演着至关重要的角色，其变化不仅直接关联着堆肥的质量与稳定性，还深刻影响着微生物的生长环境以及养分的转化与释放效率。本部分聚焦于堆肥发酵过程中物料的容重、持水孔隙度、总孔隙度和通气孔隙度等关键物理性质的动态演变规律。由图2 可见，在堆肥发酵全程中，容重与持水孔隙度显著上升（P<0.05），而总孔隙度和通气孔隙度逐渐下降。在发酵过程中，一方面，微生物的生长繁殖导致其生物量增加，填充了物料间的部分孔隙；另一方面，有机物分解产生的一些小分子物质和胶体物质，使它们更加紧密地聚集在一起，从而导致容重逐渐上升，升温期为 0.26 g/cm³，高温期升至 0.31 g/cm³，降温期达 0.33 g/cm³，腐熟期稳定于 0.34 g/cm³（图2a）。

图  2  堆肥发酵过程中物料物理性质的变化分析

注：不同字母表示差异显著（P<0.05），下同。

Figure  2.  Analysis of changes in physical properties of materials during composting fermentation

Note: Different letters indicate significant difference at 0. 05 level. The same as following.

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随着有机物的分解，会产生一些腐殖质类物质，填充在孔隙中，增加了孔隙的持水能力；同时，物料结构的紧实化也使得孔隙变小，水分在孔隙中的滞留能力增强，从而导致持水孔隙度上升，升温期为 40.1%，高温期升至 44.2%，降温期达 45.6%，腐熟期高达 46.2%（图2b）。对于总孔隙度，升温期为 71.3%，高温期变为 68.1%，降温期降至 67.4%，腐熟期进一步降至 66.2%（图2c），微生物活动和有机物分解产物导致物料颗粒紧密结合，使得大孔隙逐渐减少，小孔隙虽然有所增加，但总体孔隙体积下降，从而表现为总孔隙度逐渐降低。物料结构的变化使得大的通气孔隙被填充和压缩，微生物的生长繁殖也占据了部分孔隙空间，升温期是 31.2%，高温期降至 25.1%，降温期变为 23.3%，腐熟期降至 20.5%（图2 d）。表明随着发酵的进行，物料逐渐变得更加密实，持水能力增强，但通气性能有所减弱，这一系列的改变直观地反映了堆肥发酵进程中物料物理性质的复杂动态变化过程，为深入理解堆肥的腐熟机制和质量演变提供了重要的依据。

2.3   堆肥发酵过程中养分、有机质及发芽指数分析

堆肥过程中养分、有机质的动态变化以及发芽指数的改变对于评估堆肥的质量、成熟度具有至关重要的意义。由图3可知，发酵四个阶段中碱解氮、有效磷、速效钾及腐殖质含量呈上升趋势。升温期碱解氮含量2.23 g/kg，高温期升至2.87 g/kg，这主要是因为在高温阶段，微生物活动旺盛，尤其是一些具有氨化作用的微生物大量繁殖，将有机氮转化为氨态氮，使得碱解氮含量显著增加（P<0.05）；由于随着易分解的含氮有机物逐渐减少，导致碱解氮含量稍有下降，降温期略降至2.82 g/kg，腐熟期达2.75 g/kg（图3a）。有效磷升温期为0.29 g/kg，高温期升至0.32 g/kg，微生物分泌的有机酸等物质能够溶解物料中难溶性的磷，使其转化为有效磷；同时，有机物的分解也会释放出一部分原本与有机物结合的磷，增加了有效磷的含量；随着发酵的持续进行，磷的转化过程逐渐趋于稳定，降温期为0.34 g/kg，腐熟期稳定在0.34 g/kg（图3b）。速效钾升温期含量为 0.72 g/kg，高温期升至 0.80 g/kg，这是由于在高温阶段，含钾矿物质的分解以及有机物中钾的释放速度加快，使得速效钾含量上升；降温期继续上升至 0.82 g/kg，腐熟期达 0.85 g/kg（图3c），可能是因为随着发酵进程推进，更多的钾元素从复杂的物质结构中被释放出来。随着发酵的深入，在微生物的作用下，有机物参与到腐殖质的形成过程中，使得腐殖质含量持续增加，升温期302.5 g/kg，高温期增长至326.2 g/kg，降温期升至336.4 g/kg，腐熟期升至344.6 g/kg（图3 d）。经统计学差异性分析表明，这些养分含量在不同阶段的变化具有显著差异（P<0.05），说明随着发酵的进行，养分不断转化和积累，为后续的土壤改良和作物生长提供了潜在的营养支持。微生物在发酵过程中将有机质作为能源物质进行分解代谢，大量的有机物被分解为二氧化碳、水和小分子的有机化合物，升温期为442.7 g/kg，高温期降至419.2 g/kg，降温期缓慢降至410.4 g/kg，腐熟期持续降至404.2 g/kg（图3e），与升温期相比，各阶段下降具有显著意义（P<0.05），反映了有机物在发酵过程中的分解和转化，这是堆肥腐熟过程中的必然趋势，随着有机质的分解，堆肥逐渐趋于稳定和成熟。发芽指数先降后升，升温期62.3%，高温期降至52.1%，降温期升至73.2%，腐熟期继续升至93.5%；在发酵初期，堆肥中可能存在一些未完全分解的有机物，它们在微生物作用下会产生一些对种子发芽有抑制作用的物质，如有机酸、酚类化合物等；随着发酵的进行，有害物质逐渐被分解转化，反而为种子发芽提供了良好的养分和环境条件，使得堆肥产物对种子发芽的抑制作用减弱，甚至转为促进作用，这也表明堆肥逐渐成熟，堆肥质量达到了较高的水平（图3f）。

图  3  堆肥发酵过程中养分、有机质及发芽指数分析

Figure  3.  Analysis of nutrients, organic matter and germination index during composting fermentation process

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2.4   堆肥发酵过程中细菌群落结构演变、多样性变化及与环境因素的相关性分析

细菌群落结构及其多样性在堆肥发酵过程中扮演着关键角色，不仅深刻反映了堆肥内部生态系统的动态变化，还与堆肥的质量、效率以及最终产品的稳定性紧密相连。本研究聚焦于深入剖析堆肥发酵各阶段细菌群落从物种组成到群落结构的演变机制，运用多样性指数精确量化其变化趋势，并借助主成分分析直观呈现群落结构的差异特征。同时，通过 Spearman 相关性分析探究环境因素与优势细菌门类之间的内在关联。在堆肥发酵初期，物料中含有相对丰富的易分解有机物，能够被各类微生物广泛利用，从而使得多种微生物都能在这个阶段存活和生长；随着发酵的推进，不同微生物对营养物质的利用能力和偏好逐渐显现差异；从分类层级动态来看，高级分类单元（界、门）的组成在发酵全程保持稳定，而低级分类单元（属、种）的多样性随发酵阶段变化（图4a）。不同阶段的环境筛选作用使得能够适应相应条件的细菌得以生存和发展，最终形成了各阶段独特的细菌群落结构以及相对稳定的14个核心细菌类群（图4b）。

图  4  堆肥过程细菌群落结构演变、多样性变化及与环境因素的相关性分析

注：图4b中的数字为操作分类单元；图4c、d、e、h中的*，**，分别代表P＜0.05，P＜0.01。

Figure  4.  Analysis of bacterial community structure evolution, diversity dynamics, and correlations with environmental factors during composting

Note: The numbers in Figure 4b represent the operational classification units;*, * *, respectively represent P<0.05 and P<0.01.

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在发酵初期优势菌群迅速生长，抑制了其他细菌类群的发展，导致群落的均匀度较低，物种丰富度相对不高，使得整体多样性处于较低水平；而随着发酵的进行，进入其他阶段后，环境条件的变化、有机物的持续分解转化以及微生物之间的相互作用，使得更多种类的细菌能够获得适宜的生长条件，体现出Chao1指数上升（图4c），和升温期Simpson和Shannon指数较低，其他阶段升高（图4 d～e）。在堆肥的各个阶段，环境因素和物料的化学组成持续发生变化，这些变化对不同细菌类群的生长和生存产生了选择性压力，导致细菌群落的组成和结构不断调整和演变，从而在主坐标分析中表现为不同阶段的细菌群落分布在不同的位置，且随着发酵阶段的推进，这种差异逐渐增大（图4f）。升温期厚壁菌门主导，高温期变形菌门占比高，降温期厚壁菌门和热袍菌门占优，腐熟期放线菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为主（图4 g）。Spearman相关性分析显示，绿弯菌门、放线菌门、厚壁菌门_G与呈水负相关，而变形菌门与水呈正相关；这可能是因为绿弯菌门、放线菌门、厚壁菌门_G中的部分细菌对水分含量较为敏感，过高的水分可能会影响它们的气体交换、营养物质的摄取，从而限制了它们的生长和代谢活动；而变形菌门中的一些类群可能更适应较高的水分环境，有利于它们获取营养物质、扩散代谢产物，因此表现出与水正相关。变形菌门、厚壁菌门_D与电导率负相关，可能是因为这些细菌在低离子浓度环境下更有利于其细胞膜的稳定性和物质运输等生理过程，高电导率环境可能会干扰它们的正常代谢；放线菌门、绿弯菌门和厚壁菌门_G正相关，可能是由于这些细菌具有一些特殊的离子转运机制或代谢途径，能够适应较高的离子浓度环境，甚至可以利用这些离子来满足自身的生长和代谢需求；拟杆菌门与pH值正相关（图4 h），这是因为拟杆菌门中的许多细菌具有适应相对较高 pH 值环境的生理特性，在堆肥过程中随着 pH 值的升高，拟杆菌门的相对丰度增加。这些结果表明堆肥发酵中环境因素通过影响优势细菌门的生长代谢，进而对细菌群落结构、功能、发酵效率和质量产生重要影响，揭示了堆肥过程中微生物群落与环境之间复杂而紧密的相互作用关系。

3.   讨　论

本研究验证了堆肥过程四阶段划分及其理化性质与微生物变化规律，与宋芸等^[19]、徐瑞蔓等^[20]的研究结论一致，特别是温度变化与微生物代谢的关联性^[21]。与MA等^[16]的差异可能源于原料成分差异及其添加菌剂对微生物群落的调控作用，导致其升温更快但高温期较短^[20,22]。采用的大规模自然堆肥虽然存在环境控制精度不足、未系统分析原料特异性影响等局限性，但更贴近实际生产且具备保温优势^[23]。种子发芽指数的先降后升趋势印证了堆肥生物毒性动态，初期有机酸/酚类物质抑制^[24-25]与后期高温降解^[26-27]的协同作用解释了该现象，与松木屑发酵规律相似^[28]。

堆肥过程中微生物群落的动态演替主导着有机物降解进程。本研究表明，细菌群落随发酵进程呈现显著结构演替，其多样性增加导致原有优势菌群地位更迭。厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门作为核心菌群被不同体系堆肥研究反复验证^[29-30]，暗示其对堆肥环境的关键功能具有广泛适应性。值得注意的是，王孝芳等^[31]提出的微生物阶段性占优规律在本研究中得到印证：温度场与微生物活动存在双向调控机制，菌群代谢驱动堆体温度变化，而热环境演变又反向选择适生菌种。需指出，食用菌菌渣预处理虽部分降解纤维素组分，但对真菌功能解析尚存局限。后续拟结合多组学技术和基质组分分析，系统揭示微生物互作网络，为优化堆肥工艺提供理论支撑。

堆肥过程中微生物群落呈现阶段性演替。升温阶段，厚壁菌门通过降解易分解有机物促进温度上升，其生长规律具有跨体系普遍性^[32-33]，可通过优化原料预处理（如增加易分解有机物）强化其活性。高温期，变形菌门取代厚壁菌门成为优势菌群^[34]，加速有机物分解及腐殖质形成^[35]，需调控通风与保温以维持其功能。降温阶段，厚壁菌门通过利用中间产物保障堆肥系统平稳过渡^[36]，需避免温度剧烈波动。腐熟期，放线菌门、厚壁菌门与拟杆菌门协同作用：放线菌门通过次级代谢产物抑制有害菌^[37]，厚壁菌门分解残余有机物^[38]，拟杆菌门降解顽固多糖^[39]，三者共同推动腐熟，需调控湿度、pH等参数优化其活性。未来研究应进一步解析纤维素和木质素的动态降解过程，并系统评估不同原料配比对堆肥效率及微生物功能的影响，以优化农业废弃物资源化利用工艺。

4.   结　论

本研究表明，紫苏叶中药渣与杏鲍菇菌渣混合堆肥历经升温、高温、降温及腐熟四个阶段，过程中各项指标呈现规律性动态改变。

1）物理性质方面，容重从0.26 g/cm³显著上升至0.34 g/cm³；持水孔隙度从40.1%增加至46.2%；总孔隙度和通气孔隙度则分别从31.2%、71.3%下降至20.5%、66.2%；

2）养分含量方面，除有机质下降外，碱解氮、有效磷等其余养分含量均上升，发芽指数从62.3%先降到52.1%后升到93.5%；

3）细菌群落结构方面，从升温期厚壁菌门主导逐渐演变为腐熟期放线菌门等为主，多样性和均匀度增加且优势菌群主导地位减弱，同时不同细菌类群与水、电导率、pH值存在特定相关性，整体揭示了堆肥过程中物质转化与微生物活动的协同机制。

本研究揭示了紫苏叶药渣-菌渣混合堆肥过程中物质转化与微生物活动的协同机制，为优化农业废弃物资源化利用提供了理论依据，并可通过调控优势菌群提升堆肥产品稳定性。